RBSDV 提取方法

實(shí)驗(yàn)試劑

提取緩沖液Ⅰ（GMT）[ 詳細(xì)信息：

   Glycine             0.3mol/l

   MgCl₂              0.03mol/l

   Tris-HCl           0.05mol/l  (pH 7.5) ]
 

提取緩沖液Ⅱ(PB)     [ 詳細(xì)信息：

   Na₂HPO₄           0.1mol/l

   KH₂PO₄            0.1mol/l   (pH 5.8)

pH較低的PB 緩沖液可以穩(wěn)定完整的病毒粒子，但產(chǎn)量可能有一定的影響。]

實(shí)驗(yàn)步驟

1.      取新鮮病葉100g剪成1cm碎片，加350ml提取緩沖液a，攪碎；

2.      用從重紗布過濾；

3.      加TritonX-100至3%（得到的多為較完整的病毒粒子，但產(chǎn)量低；若加四氯化碳至30% TritonX-100至2% 則可獲得大量的亞病毒粒子），4℃攪拌1h；

4.      5,000×g離心20 min，4℃;

5.      取液相鋪在1/3管體積的40%的蔗糖墊上，40,000×g 離心1.5h，4℃；

6.      用2ml緩沖液懸浮沉淀；

7.      3,500×g離心5min；

8.      上清用緩沖液稀釋后40,000×g，1.5h，4℃，濃縮，懸浮后可以得到病毒的粗提物，若要獲得比較純的病毒提取物則鋪在20%-50%的蔗糖密度梯度上，80,000×g離心1.5h，4℃；

9.      自上而下依次取每管2ml離心后的溶液，電鏡觀察，含病毒量高的管用緩沖液稀釋后40,000×g，1.5h，4℃濃縮，適量緩沖液懸浮。

注意事項(xiàng)

由于病毒粒子主要存在于微管束內(nèi)，以韌皮部居多，所以可將緩沖液體積降低到1/10然后用絞肉機(jī)攪碎。