ELISA試驗的標準曲線和測定的重復性差，這是什么原因造成的？

其實，這個問題我們經常遇到，試驗的標準曲線和測定的重復性差，這是典型的由測定操作引起的問題，常見原因如下：

a)可能原因：加樣本及試劑量不準；孔間不一致；

解決方法：校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時要緊密。

重復某一樣品時，加樣時間盡可能與**次接近；

重復測定標本，操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；

樣品稀釋前應充分混勻。

b)可能原因：加樣過快，孔間發生污染；

解決方法：重復測定標本，操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；加樣不要過快。         

c)可能原因：加錯樣本；

解決方法：檢查記錄和試劑，是否加錯樣本。

d)可能原因：加樣本及試劑時，加在孔壁上部非包被區；

解決方法：加樣槍頭不要貼壁。

e)可能原因：不同批號試劑盒中組分混用；

解決方法：不同批號試劑盒中組分不可混用。

f)可能原因：溫育時間、洗板、顯色時間不一致；

解決方法：檢查時間是否一致。

g)可能原因：孔內污染雜物；

解決方法：離心樣品，排除雜物。

h)可能原因：試劑/樣品沒有混勻；

解決方法：充分混勻樣品和試劑。

i)可能原因：血清標本未完全凝固即加入，反應孔內出現纖維蛋白凝固或殘留血    

細胞，易出現假陽性反應等。

解決方法：待血清標本完全凝固后做試驗。

在實驗室，對試劑準備一般不太注意，通常的做法是，在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時間不夠的問題，其直接的后果是對一些弱陽性標本的檢測出現假陰性。
    因此，在ELISA測定中試劑的準備*為關鍵的是，在實驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20min以上后，再進行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應步驟中，能使反應微孔內的溫度較快地達到所要求的高度，以滿足測定要求。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實驗室使用時對所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應保證質量。
此外，當試劑盒以OPD為底物時，則底物溶液應在反應顯色前臨時配制。